基因敲除载体构建原理？

一、基因敲除载体构建原理？

下面是基因敲除载体构建的基本原理：

选择目标基因并设计基因敲除载体。首先，需要确定要敲除的目标基因并对其进行分析，了解其序列和功能。然后，设计基因敲除载体，该载体通常包含一个选择标记和两个引物序列，其中每个引物序列都与目标基因两端的序列相匹配。

克隆引物序列。从目标基因中选择两个引物序列，并通过PCR扩增这些序列。这将生成一对具有互补末端的DNA片段。

克隆选择标记。选择标记可以是抗生素抗性基因、荧光标记基因等。在构建基因敲除载体时，可以将选择标记与引物序列组合在一起，形成一个线性的DNA分子。

转染细胞。将构建的基因敲除载体在细胞培养基中与目标细胞进行转染。在转染后，选择标记会进入细胞核，并与目标基因进行同源重组。这将导致目标基因发生敲除。

鉴定转染细胞。进行筛选，找到含有基因敲除载体的细胞。通常，会选择对选择标记敏感的培养基作为筛选条件，以去除未成功敲除目标基因的细胞。

确认敲除效果。通过PCR、Western blot或其他实验技术来验证基因敲除的效果。例如，可以检测目标基因表达水平是否降低或消失、蛋白质是否被抑制或消失等。

二、基因敲除是CDS序列还是基因序列？

不需要！现在的基因敲除技术都是在某基因CDS序列里面挑个靠近启动子的位点做插入缺失突变就行。基因的结构不就是三联体密码子嘛只要有一个碱基的插入或者缺失都会导致移码突变，这段基因也就不能正常编码蛋白质，这样就算是基因敲除了。现在常用的基因敲除的方法最多的就是用Cas9，之前还有过ZFNS和TALEN。这些技术的核心都是在目的位点形成DSBs（DNA双链断裂）引发生物体自身的修复功能。

但这种修复往往是不够精确的，容易带入插入缺失突变，这种突变就是我们所说的基因敲除。

三、转基因与基因敲除/敲进的区别？

转基因是利用现代生物技术，将人们所研究的target gene，经过人工分离、重组后，导入并整合到生物体的基因组中，从而改善生物原有的性状或赋予其新的优良性状。转基因除了外源基因的克隆、表达载体构建之外，还可以可通过CRIPSR/Cas9/piggbac/显微注射等方法，技术来遗传转化体系的建立、遗传转化体的筛选、遗传稳定性分析和回交转育等。

基因敲除是就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能

四、植物基因敲除作用的意义？

基因敲除的意义在于可以通过基因的缺陷进行试验，从而得出基因对病理生理的影响。

基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。

五、基因敲除的原理和方法？

直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：

①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。

②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。

③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。

④.选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10-2 ～10-5 ，植物的概率为10-4 ～10-5 。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。其中应用最多的是PNS法。

⑤.表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

⑥.得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

六、基因插入与基因敲除一样吗？

不一样。一个是用减法影响表达，一个是用加法影响表达。基因敲入有两种，一种是原位敲入,即在原基因敲除的位点插入新基因,它是基因敲除的逆过程；另一种是定点敲入,即无论敲除基因的位点在哪里,敲入的基因是在特定启动子下，以转移载体的形式转座进去,所以插入的位点是一定的。

七、遗传学方面的问题。在小鼠中通过基因敲除技术去掉蛋白质A后小鼠正常存活,去掉蛋白？

因为敲除A蛋白后小鼠正常生活，所以A蛋白对小鼠生存非必须。

八、关于“基因敲除”的原理和本质？

所谓的基因敲除就是基因沉默，是突变的一种，叫沉默突变 详细解释一下，基因重组是减数分裂过程中出现的，显然与基因敲除无关。就算是你说的将基因完全删除的情况，也不叫染色体变异，因为染色体上包括众多基因，平均20MB就至少有一个基因，而染色体大小一般都几十个MB。

九、crisprcas9基因敲除技术流程？

CRISPR/Cas 是进行基因编辑的强大工具，可以对基因进行定点的精确编辑。在向导 RNA（guide RNA， gRNA）和 Cas9 蛋白的参与下，待编辑的细胞基因组 DNA 将被看作病毒或外源 DNA，被精确剪切。

一、寻找目的基因的靶标

使用在线设计网站 CRISPR direct，如需直接复制网址，可在生物学霸后台对话框回复 direct即可。

靶点挑选要点：

基因敲除靶点应设计在起始密码子附近（包括起始密码子）或者起始密码子下游的外显子范围内。

不同 Cas9/gRNA 靶点在基因敲除效率上有较大差异，因此同时设计构建 2～3 个靶点的基因敲除载体再从中选出敲减效果较佳的靶点。

N1-N20 NGG 靠近 PAM 的碱基对靶点的特异性很重要，前 7～12 个碱基的错配对 Cas9 切割效率影响较小。设计好的靶点序列应在基因库中进行 BLAST 检测。

Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距 20～30bp 的靶点配对。多对靶点的敲除效率常有较大差异。由于基因敲除实验时间长，在正式对目的细胞进行敲除前对靶点进行验证和挑选非常必要。

二、   插入片段设计

插入寡核苷酸序列设计（必须 PAGE 纯化寡核苷酸）：

正向序列

5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’

反向序列

3’TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’

插入片段的合成

用水将寡核苷酸稀释为 100 μM。按以下体系配制退火反应体系：

正义寡核苷酸（100 μM）5μl

反义寡核苷酸（100 μM）5μl

NaCl 100 mM（终浓度）

Tris‐Cl pH7.4 50 mM（终浓度）

加水补足 50 μl

将配制好的退火反应缓冲液重复混合，短暂离心后放置 PCR 仪上，运行以下程序： 90℃ 4 min， 70℃ 10 min， 55℃ 10 min， 40℃ 10 min， 25℃ 10 min。退火后的寡核苷酸可以立刻使用或者在 ‐20℃ 长期保存。

三、   pCas9/gRNA 基因敲除载体的构建

用 EcoRV 酶切 2 μg pCas9/gRNA 载体（inovogen）。通常情况下用大约 20～30 单位的酶大约 3 小时可以酶切完全。酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量，通常线性化载体的工作浓度为 50～100ng/μl。连接用水将退火后双链寡核苷酸 (10 μM) 稀释 100 倍备用。

连接反应体系：

T4 DNA 连接酶 5U

EcoRV 5U

线性化载体 2 μl

稀释 100 倍后双链寡核苷酸 1 μl

10× 连接酶 Buffer 1 μl

50% PEG4000 1 μl

加水补足 10 μl

反应条件： 22℃ 30 min， 37℃ 15 min。

注：

平末端连接效率较低，在连接体系中添加 PEG4000 可以提高连接效率。

在连接体系中添加 EcoRV 酶可以显著提高阳性率。

四、     转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 PCR 鉴定阳性克隆

挑选阳性克隆进行测序验证, 验证正确后, 提取质粒进行转染试验, 关于 sgRNA 是否有效。可以转染之后，直接提取 DNA，通过测序验证，如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是 sgRNA 有效，如果没有则该 sgRNA 无效。

十、植物基因敲除的原理和方法？

基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。

通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。