qpcr扩增的原理和步骤？

一、qpcr扩增的原理和步骤？

定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

RT-qPCR的一步法与两步法

RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

二、qpcr检测铁过载的原理？

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

三、pcr和qpcr的原理和区别？

RT-PCR和一般的PCR相比原理上没有太多的区别，无非就是在反转时候RNA的定量，不同模板的设定。对引物没有特别的要求，能特异代表目的基因就行。

real-time PCR根据原理的不同，引物选择也不同。通常用的是SYBR Green的方法，这种方法引物在RT-PCR的基础上需要注意：

1.退火温度同内参；

2.片段长度不要超过200； real-time PCR的引物可以跑RT-PCR，反之不一定。

四、rt-qpcr与qpcr的区别？

虽然Real-time PCR（实时荧光定量PCR）和Reverse transcription PCR（反转录PCR）看

起来都可以缩写为RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR

特指反转录PCR，而Real-time PCR一般缩写为qPCR（quantitative real-time PCR）。 更正楼主的观点：qPCR不一定与反转录相关，除了可以用cDNA作为模板，也可以用基因组DNA等作为模板。而反转录PCR也不一定非要与荧光定量相关，从mRNA中反转录得到cDNA，然后PCR扩增出目的基因，这也是反转录PCR。 综上，那RT-qPCR（也有人写成qRT-PCR）就很好理解了，就是结合了荧光定量技术的反转录PCR：先从RNA反转录得到cDNA（RT），然后用Real-time PCR进行定量分析（qPCR）。

五、qpcr技术的基本原理和过程？

基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

二、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

六、qpcr 退火温度？

1、退火温度低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值（Tm值=4(G+C) +2(A+T)）为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

2、延伸时间：1min/kb(10kb内）。引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。扩展资料PCR的过程：1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

七、rtpcr和qpcr区别？

RT-PCR是real-time PCR的话，和qPCR是一样的，都是荧光定量PCR。相比普通PCR，会加入染料，便于收集荧光信号。结果可以得出相对/绝对 浓度等多组数据，然后根据你的目的，对实际数据进行分析。还能通过ntc的ct值判断实验合不合格。

八、qpcr数值如何计算？

阈值= 基线（背景）信号标准偏差*10。（3-15个循环）。当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。

九、qpcr如何设置阈值？

阈值最好取在直线上升的区域段，即呈对数增长的那一段，不然的话，信号不稳，而且Ct值也不准。 那条阈值的线可以拖动的，你自己调整一下。

（最后计算出来的结果和阈值的大小没有关系，所以你胆子大点，下手吧~）

十、qpcr标本怎么保存？

qpcr的标本一般都是dna，所以比较稳定，放在负20冰箱即可。