实验步骤:
1. 样品预处理:即通过超声这种细胞破碎的手段,将在大肠杆菌E.coli中表达的重组的带6个His标签的绿色荧光蛋白释放到相应的缓冲液当中,再通过离心,0.2微米滤膜过滤等去除细胞碎片和别的污染物;
2. 组氨酸标签蛋白亲和层析:HisTrapTMHP crude, 1mL预装层析柱,进行亲和层析,一步就可以达到90%左右的纯度
3. 凝胶过滤层析脱盐去除咪唑:HiTrapTM Desalting 5mL预装层析柱进行脱盐,置换缓冲液
4. 电泳:对纯化过的样品的检测。
原理:
亲和层析是一种吸附层析,抗原(或抗体)和相应的抗体(或抗原)发生特异性结合,而这种结合在一定的条件下又是可逆的。
所以将抗原(或抗体)固相化后,就可以使存在液相中的相应抗体(或抗原)选择性地结合在固相载体上,借以与液相中的其他蛋白质分开,达到分离提纯的目的。此法具有高效、快速、简便等优点。
亲和层析是一种吸附层析,抗原(或抗体)和相应的抗体(或抗原)发生特异性结合,而这种结合在一定的条件下又是可逆的。
所以将抗原(或抗体)固相化后,就可以使存在液相中的相应抗体(或抗原)选择性地结合在固相载体上,借以与液相中的其他蛋白质分开,达到分离提纯的目的。此法具有高效、快速、简便等优点。
蛋白质的分子量不同
凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体,不带电荷,吸附力弱,操作条件比较温和,可在相当广的温度范围下进行,不需要有机溶剂,并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术,又称之凝胶过滤,分子筛层析或排阻层析。
层析柱是凝胶层析技术中的主体,一般用玻璃管或有机玻璃管。根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同,从而分离的一种层析法。柱层析技术(chromatography) 又称柱色谱技术,主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同,经多次反复分配将组分分离开来
柱层析原理:
柱层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使各组分分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附,极性较弱的物质不易被硅胶吸附。当采用溶剂洗脱时,发生一系列吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程,吸附力较强的组分,移动的距离小,后出柱;吸附力较弱的组分,移动的距离大,先出柱。
纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。其原理是:利用混合物各组分在流动相和固定相两种不同溶剂中的分配系数差异,将它们分离开来,在纸层析中的流动相是指层析液,在毛细拉力作用下,层析液能不断由下向上流动。
由于纤维素上的亲水羟基使这部分水围绕在纤维素周围,不易扩散而形成固定相。在层析过程中,当层析液在毛细拉力作用下,上升流经色素滤液细线时,滤液细线上的色素就相继融入层析液,随着层析液上升,并发生分配,即有一部分色素从层析液分配溶解到固定相中,直到平衡
一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时,各分子在柱内同时进行着两种不同的运动:垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔,而只能分布颗粒之间,所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,即进入凝胶相内,在向下移动的过程中,从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入和扩散,小分子物质的下移速度落后于大分子物质,从而使样品中分子大的先流出色谱柱,中等分子的后流出,分子最小的最后流出,这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。
提亲、相亲、订婚是我国传统婚姻文化的三个阶段,各具有不同的意义和功能。1.提亲是古代男女关系的第一步,通过互相报告姓名、籍贯、年龄、父姓等基本信息,表示有意向结亲。 2.相亲的目的是通过面对面的交往来考察女方的真实情况和相貌特征,并用这些情况和特征作为决定性的原则,从而决定是否结婚。 3.订婚是当两家达成一致后,通过以礼证明意愿力,告知亲友达成婚姻意向,以示将来要结婚。现在提亲和相亲在都在逐渐退出社会视野。现今的年轻人更多地是通过网络等方式认识对方,通过短暂的相处和交往来选择自己的伴侣, 或者走上人生的另一片天地。
本质是在于和谐。色谱的亲和力来自于色彩的邻近色以及调和的互补色。让所有的色彩放在一起即有对比又和谐统一
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