t载体连接原理？

一、t载体连接原理？

TA原理就是在做PCR的过程中，DNA聚合酶（Taq酶）在扩增完之后的3'末端总会多加一个带A的核苷酸，形成仅一个突出A的粘性末端PCR产物。 TA连接的原理就是: 扩出来带A的PCR片段与商品化的T载体进行连接。T 载体就是只有一个T核苷酸突出碱基的载体（目前T载体都已经商品化，只需购买就行了），这样单个T和单个A 就很容易连接在一起，就可以做转化验证了。

二、18t载体连接步骤？

步骤

PCR产物纯化后测定DNA的浓度，按照适当的比例与T-Vector在含有连接酶的buffer中4°过夜或37°3小时连接，然后连接产物涂筛选平板（ALB)筛选即可。

方法1、以T4连接酶进行连接的方法，这种方法的载体 有P公司、T公司，

可以说这两家公司将这两种方法发挥到了很高的水平，转化子比较多，阳性率

也不错，唯一的不足就是连接的时间长。因为连接时间越长效率越高，要达到较好的连接效率，一般要过夜连接。国内很多公司模仿这种方法制作T载体 ，不仅连接时间也很长，而且做不到P公司、T公司的阳性率和稳定性。

方法2、以拓扑异构酶(TOPO)进行连接的方法，最早采用这种连接方法的是I公司，并且申请了专利，这种方法的优势是快速连接，在5-15分钟就可以将目的基因克隆到载体 中，阳性率比较高。

三、t4载体正确连接方法？

首先是T,A连接,就是现在通常使用的T载体,一般的PCR产物都在两端加个A,这样T,A相配,T4连接酶可以把他们连在一起.第二,粘性酶切位点连接,把载体和外源基因用相同的酶进行酶切（双酶切,或者单酶切都可以）回收相应的片段,用酶切出来的粘性末端进行配对,T4连接酶进行连接.第三,平末端连接,也是用酶切,平末端也可以用T4连接酶连接,不过连接效率低的很.第四,同源重组,用一个含有目的基因的载体A和另外一个载体B共转染（转化）宿主,可以通过同源重组产生包含目的基因的B载体.多用在病毒载体和重组病毒的构建上.

四、连接t载体转化注意事项？

PCR产物纯化后测定DNA的浓度，按照适当的比例与T-Vector在含有连接酶的buffer中4°过夜或37°3小时连接，然后连接产物涂筛选平板（ALB)筛选即可。

要确保产物末端有A尾，如果是高保真酶扩增的产物需先加A尾，纯化后再连接；再就是载体和产物的比例要合适。

五、pcr产物与t载体连接靠什么？

因为PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3'加上A。例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。只有用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA片段才能通过T/A配对进行连接。通过PCR的方法扩增目的基因片段的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片段通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：

（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。

六、top载体原理？

t0P载体原理是用最小启动子的萤火虫荧光素酶报告系统载体中，构建得到TOP-Flash质粒。

该质粒可依据beta-catenin的活性强弱，调控下游萤火虫荧光素酶的表达量高低。进而将实验简化为检测荧光素酶的活性。同时为了减少误差，该系统还设计了包含突变。

七、topo载体原理？

topo载体，也就是拓扑异构酶，是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑结构，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模版的调节。

基于拓扑异构酶（Toposiomerase）的克隆（TOPO cloning）是一种不利用限制酶和连接酶的DNA克隆方法，该技术依赖于A和T碱基的互补配对。本文关注于粘性末端的TOPO（也称为TOPO-TA）克隆，但其实TOPO克隆也可以用于平头末端克隆。

八、人工载体工作原理？

质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。

九、什么是t载体？

通过克隆甘露聚糖酶基因到pMD-18T载体构建了质粒pMD-18Tman2XcmI,克隆的甘露聚糖酶基因两侧各引进了一个特定的XcmI酶切位点;用XcmI酶切质粒pMD-18Tman2XcmI可以制备T载体.因为甘露聚糖酶基因作为填充片段和筛选标记受半乳糖苷酶基因启动子的控制,甘露聚糖酶能够表达,从而水解甘露聚糖产生水解圈,指示转化了部分酶切质粒的背景菌落.此外,在甘露聚糖酶基因中存在第3个不同序列的XcmI酶切位点,因此残余的甘露聚糖酶基因引起的背景可以进一步降低.抽提大量质粒贮存,随时制备T载体使用,增加了克隆的稳定性.该T载体克服了一般T载体质量不稳定,费钱,克隆效率低,假阳性高的缺点.使用构建的T载体完成了10个基因的克隆,结果表明重组效率达到了90％～100％.

十、T载体是什么？

T载体又称T-vector。聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。

T载体是一种克隆载体，也就是用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体，它不能大量表达。多用于克隆PCR产物，一般用一些常见的载体改造成的，一般的DNA聚合酶没有3'-5'核酸外切酶活性，即酶的校正活性，