sanger测序和二代测序的区别？

一、sanger测序和二代测序的区别？

sanger.测序通量低，一次只能对单一的分子测序，如果是混合物，会出现杂峰，但测序长度比较长。

二代测序的通量高，缺点是测序读长较短。

二、nanopore测序仪原理？

新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）；采用电泳技术。

Nanopore测序当中的核心部件是这个由蛋白质构成的纳米级的小孔，我们称之为“Pore”。

这个蛋白质插在一层电阻率很高的薄膜当中。薄膜的两侧都浸没在含有离子的buffer当中。在薄膜的两侧加上不同的电位,离子就会通过蛋白质小孔，从膜的一侧移动到膜的另一侧，小孔当中就会有电流通过。当DNA的单链通过这个小孔的时候，就会对离子的流动造成阻碍。不同的碱基造成的阻碍大小是不一样的。这样，不同的碱基所造成电流大小的波动，就被记录下来

三、迷你测序仪定义？

迷你测序仪意思是指用以测量木材的含水量湿度和其他非导体材料相当于木材的含水量。

四、一代测序和二代测序的区别？

二代测序相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高准确性，并且大幅降低了测序时间，将一个人类基因组从3年降为1周以内，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，这也给三代测序提供了发展空间。

一代测序：又称Sanger测序

原理：ddNTP的2＇和3＇都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分别为ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

二代测序：NGS技术（多分子，多克隆）

背景：Sanger测序虽读长较长、准确性高，但由于其测序成本高、通量低等缺点，难以在de novo测序、转录组测序等方面普及应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标志的第二代测序技术诞生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技术近年来也杀入历史舞台。

1、Illumina 原理：

桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像

主要步骤：

①DNA文库制备—超声打断加接头

②Flowcell—吸附流动DNA片段

③桥式PCR扩增与变性—放大信号

④测序—测序碱基转化为光学信号

特点：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。

2、Roche 454

油包水PCR + 4种dNTP车轮大战 + 检测焦磷酸水解发光

五、二代测序与焦磷酸测序有什么关系？

焦磷酸测序技术应用存在的问题： 该技术的原理上来讲，对于多个单碱基重复的序列的准确性比较低（因为焦磷酸测序是一次加入一种碱基，所有荧光信号区分AAAA中到底有几个A是比较不准确的） 通量低，当然这个是市场所给定义的，以前illumina测序GA的时候，也没觉得其他通路有多低，但是现在PGM，next500 MISEQ，HISEQ 这一些列的测序的通量大大提高，使得其他通量显得应用中很难有发挥，现在出来种群多样性鉴定中还比较好用（说实话也被miseq给占了一半还多），454越来越少了。

其实焦磷酸测序这个技术应用在非二代测序中也有一定应用，比如甲基化的验证（现在焦磷酸测序是甲基化位点验证的金标准）

六、第二代测序技术？

第二代DNA测序技术又称下一代测序技术，是对第一代测序技术的划时代变革的核心。

现有的技术平台主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exa GenomeAnalyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScope™ Single Molecule Sequencer、美国Dana-her Motion公司推出的Polonator；以及连接法测序 (sequencing by ligation)，即通过引物来定位核酸信息，技术平台有Applied Biosystems/SOLiD™ system。以上技术平台所运用的测序原理均为循环微阵列法

七、二代测序工作安全吗？

二代测序工作是安全的。

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（SequencingbySynthesis)，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem。

八、二代测序建库流程？

第一部分DNA酶处理：试剂为PROMEGA( RQ1 RNase-Free DNase )

目的：失活DNase酶

RNA（TE洗脱）8微升

RQ1 RNase-Free DNase 10X Reaction Buffer 1微升

RQ1 RNase-Free DNase 1微升/微克RNA

合计10微升

37℃ 30分钟孵育

加1微升的RQ1 DNase 终止液

65℃ 10分钟使DNase酶失活

（PS:经验这一步最好在核酸提取之前就处理好，具体步骤如下：取样本反复冻融三次，然后一万转离心十分钟，取上清，用0.22微米的滤膜过滤，加DNase，提核酸）

第二部分RNA-seq system V2(cat.7102)

目的：生成并纯化cDNA

一、第一链合成

1. 融解第一链cDNA合成试剂（蓝色盖）和无核酸酶的水（绿色）

2. 短时离心A3ver1 放在冰上，votex A1Ver4和A2ver3，离心后放在冰上；无核酸酶水放在室温；

3. 在冰上，取2ul A1和5ul total RNA （500pg到100ng）放在0.2mlPCR管里；

4. 将PCR管放在PCR仪中运行程序1：

RNA量≤ 1ng时，65℃ 2min，4℃存放

RNA量> 1ng时，65℃ 5min，4℃存放；

5. PCR仪降到4℃后取出PCR管放在冰上，加入制备好的第一链合成试剂，每个样本加入3ul，混匀后，离心放在冰上：

第一链合成试剂：2.5ul buffer mixA2+ 0.5ul 酶混合液A3（共3ul）注意：加酶A3时要慢慢加入，反复吹打枪头至少5次确保酶加入进去

6. 把加入第一链合成剂和样本的PCR管放在PCR仪上运行程序2：

4℃ 1min，25℃ 10min，42℃ 10min，70℃ 15min，4℃hold

九、3130xl测序仪和3100测序仪区别？

区别在于特点不同，3130xl测序仪属性规格有着显著提升。多层次设计都更符合当下用户需求，3100测序仪设计语言更加丰富，显得优雅修长，更加柔美合适。沉稳大气，又不乏时尚感。

十、二代测序出现时间？

二代测序诞生在2005年左右，被称为“Next-generation sequencing”技术，简称NGS.