westernblot实验步骤？

一、westernblot实验步骤？

Western，也叫 Western blot, Western blot blot, Western印迹法，是检测蛋白质抗体的重要方法之一。

实验步骤：

1.用块称量。

2.用液氮，将组织块粉碎。

3.加入 RIPA缓冲剂(每克组织3 ml RIPA)、 PMSF (每克组织30μ l,10 mg/ml PMSF)，继续保持4℃的 Polytron (每克组织3 ml RIPA)。

4. PMSF (每克组织30μ l,10 mg/ml PMSF)，冰上孵化30分钟。

5.移入离心管，4℃大约20,000 g (15,000转)。

6.将上清作为细胞裂解液，分装-20℃保存。

7.蛋白质浓度测定采用 Bradford比色法。

8.取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，加2×电泳加样缓冲液。

9.用开水浴3分钟。

10.上样。

11.电泳(浓缩胶20 mA，分离胶35 mA)。

12.转膜仪转膜(100 mA 40分钟)。

13.薄膜为丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色。

14.显色 Westernblot试剂盒。

15.比较记录分析。

二、westernblot技术原理？

Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

三、westernblot的具体步骤？

Western blot（也称为蛋白质免疫印迹）是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术。它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 来分离指定样品中包含的各种蛋白质，然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上，接下来将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。

操作步骤：

1. 准备样品

1）制冰，准备冰盒。

2）配制细胞裂解液：根据细胞数量确定所需裂解液：50ul/六孔板一孔 。

裂解液配方：100ul碧云天裂解液+1ul蛋白酶抑制剂混合物+1ul PMSF

3）按实验需要准备好细胞：去掉培养基，1×PBS洗3次（去掉培养基中的血清），每个孔（6孔板）加入适量的裂解液。迅速用细胞刮刮下细胞并转移至1.5ml管中，置于冰上20min，振荡混合后，再置冰上10min。

4）12，000g，4℃离心15min，收集上清至另一1.5ml管。

四、wb实验步骤及原理？

WB实验的基本原理：

蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

三、WB实验步骤

(一)试剂准备

(二)蛋白样品制备

(三) 蛋白含量的测定

(四)SDS-PAGE电泳

(五)转膜

(六)免疫反应

(七)化学发光，显影，定影

(八)凝胶图象分析

五、wb详细原理及步骤？

一、WB实验的基本原理：

　　蛋白质免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除 ELISA 法外，也可用与检测 DNA 和 RNA 相类似的吸印方法。

　　与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

　　经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

六、墨汁染色原理及步骤？

生活细胞的原生质膜具有半透性（选择透性），能选择性地吸收外界（有用）物质，而死亡的细胞则丧失了这一能力。一般染料不是细胞生活所需要的物质，因而不能进入生活细胞内。

根据这一原理，人们可以利用染料染色法来鉴定种子的生活力：有生活力的种子，胚部细胞不让染料进入，因而不被染色；而丧失生活力的种子，其胚部细胞原生质膜丧失了选择透性，染料可自由进入细胞内，从而使胚部染色。因此，可根据种胚是否被染色来判断种子的生活力。

七、胶体电泳原理及步骤？

SDS 平板胶片铸造︰

1. 整理出两组玻璃片及白板铸胶组合，先用酒精拭净，并选择合适的间隔条（0.75 mm） 组合起来。请熟悉铸胶三明治组合的正确组装方式，以免灌入的胶液漏出来。

2. 三明治组合后直立站好，准备所要浓度的SDS 胶体溶液如表4.2. 两片0.75mm 厚的平板胶片约需10 mL 分离胶体溶液，以及5 mL 焦集胶体溶液。APS液到最后才加入，未加APS 以前可在真空中抽去溶液中的气体。

3.以上分离胶体各成份在小烧杯中混合均匀后，可直接沿着玻璃一侧倒入铸胶组合到预定高度 （约八成高），勿陷住气泡；再轻轻加上一层isopropanol. 也可使用滴管慢慢加入胶体，同样勿注入气泡。

4. 约30 min 可凝结，以滤纸吸去isopropanol,同法倒入焦集胶体溶液，要加到满；尽快插入样品槽齿模，注意不可有气泡陷在胶体中。一般在凝胶完成后，胶体与所加的水层的间，会出现清楚的直线界面，但因为背景为白色，较不易观察的。

5.再度凝结后取下齿模即可使用。若不立刻使用，则把整个胶片组合用保鲜膜包好，胶面上方加一水层，勿使干掉，在4℃约可放1~2 周。

电泳方法︰

6. 若胶片组合保存于4℃，则要等待胶片完全回复室温，才架到电泳槽。胶片一定要完全回温，否则在进行电泳时，玻璃会因热胀而破裂。

7.取F液稀释成一倍溶液，并加SDS成为0.1%;先倒入下方的正极槽，注意不可有气泡黏在胶体，然后倒入上方的负极槽。用微量针筒或微量移液器一个一个清洗样本槽，除去残留在槽内的胶体 （刷牙）。刷牙的动作很重要，而且要彻底，否则注入样本时，会有大麻烦。又因为白色氧化铝板乃白色背景，不容易看出样本槽的位置，可用Hoefer 所附的透明样本槽位置模板，作为指引，顺便可练习样本添加的动作。

8. 取蛋白质样本溶液，加入同体积E 液，以及适量追踪染料bromophenol blue,混匀后在100℃加热10 min.放冷短暂离心后即可依次以微量移液器注入样本槽，样本体积可自斟酌，但要记好位置及体积；通常都使用5~15uL.注入样本时，尽量把针头或吸管伸到样本槽底部，但不要触到样本槽底的胶面，则可以使得样本所占的体积最小，分离效果较好。

9. 装上电源盖，以100~150 V进行电泳，最高可加至200 V,视实验的紧急程度，以及胶片发热的情形而定。通电后两极附近会立刻产生无数细微气泡，是通电的特征。

10.追踪染料很快进入胶体，开始焦集成蓝色细线，并向下泳动，大约1 h 可泳动到底边，中止电泳，除去电源盖。有些分子量较大的样本，或使用浓度较高的胶片，可以等到蓝色细线泳出胶体才停止。

胶片染色法：

11.取出胶片组合，使玻璃板向上，先除去两侧间隔条，再以扁形药匙轻轻撬起玻璃，胶片则留在白板上。切除焦集胶体，并在分离胶片的右上方截角做记号 （区别胶片的左右）。

12. 取染色盘 （大约比胶片稍大），倒入CBR染色液，在染色盘上方把上述白板倒翻过来，挑起胶片一角，利用重力使胶片掉落到染色缸中。若要进行蛋白质转印，则胶片不能染色，要浸入转印缓冲液中。

13.在CBR 中染色约30 min,染色盘要加密盖，置于旋转平台慢速50 rpm 摇荡的；要注意胶片是否完全没入染色液中，否则会造成染色不均匀。

14.染色后小心把CBR 染剂倒回原来瓶中，整块胶片变成蓝色，先用自来水洗掉残余的染色液，再倒入约20 mL 脱色液，加密盖后再放回旋转平台摇荡。染色脱色过程请戴手套，否则会在胶片上留下指纹。

15. 胶片的蓝色背景渐渐脱掉，待脱色液转成蓝色后，可以换新脱色液；如此脱色数次，在一小时内应可看到蛋白质的蓝色色带出现。用过的脱色液，请回收倒在有机溶液的废液桶中。

16. 待胶片背景完全透明后，染色脱色完成。倒去脱色液，改用50%甲醇液洗一两次，待胶片缩至大约原来的尺寸，则可准备干燥的。

胶片干燥法：

17.把玻璃纸cellophane 先用水浸湿，平铺在干燥用的玻璃片上，玻璃纸会比玻璃片大，因此四周有多出来的部份。

18.把胶片平铺在玻璃纸中央，胶片与玻璃纸间不要有任何气泡。 除了气泡的外，若胶片没有回复原来的大小，或者胶片的四边有伤痕，都很容易造成胶片干燥后的龟裂现象。

19. 在胶片上再加一层浸湿的玻璃纸，也不要陷有气泡在内；把玻璃纸多出来的部份反折到玻璃背面，用手抹平表面水份，并用纸巾吸干。

20.把此干片三明治组合放在桌上，次日即可得到已经干燥好的胶片，用电风扇或冷气机吹的，可以加快干片速度。 干片后用指甲尖轻敲胶片，若还可以看到指甲所留下的痕迹，表示胶片并未完全干燥，要再等候。

21. 待胶片完全干燥后，以美工刀或剪刀去除多余的玻璃纸，再加以护贝，则可永久保存的。免疫染色的转印纸，也可以护贝保存。

八、蛋白纯化原理及步骤？

蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。

蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。

九、振动实验原理及步骤？

振动实验是研究物体振动特性的实验方法。下面是一般的振动实验原理及步骤：

原理：

振动实验基于物体固有的机械振动特性，通过对物体施加外力或激励，观察和测量物体振动的参数来研究其振动特性。根据物体振动的种类，振动实验可以分为自由振动、阻尼振动和受迫振动等。

步骤：

1. 实验准备：确定实验目标，选取合适的振动系统，例如弹簧振子或单摆等，准备实验器材，如弹簧、小球或者线性传感器等。

2. 构建振动系统：根据实验目标和选定的振动系统，搭建物体的振动装置，确保系统安装牢固。

3. 设置初始条件：确定物体的初始位置、初始速度等初始条件，并将物体置于平衡位置。

4. 施加外力或激励：选择适当的激励方式，如施加力或扰动物体，或者通过外部激励器件施加外力。

5. 观测和测量：启动振动系统并启动计时器，观察并测量物体振动的参数，如振动频率、振幅、周期等。可以借助传感器或实验仪器进行自动记录和测量。

6. 分析数据：根据测得的数据，计算振动实验的结果，并进行数据处理和分析，如绘制振动曲线或进行频谱分析等。

7. 总结和归纳：根据实验结果，总结和归纳所研究物体的振动特性，形成实验报告或研究成果。

需要注意的是，具体的振动实验步骤和操作方法会根据不同的实验目标和实验设备而有所不同。建议在进行实验前仔细阅读实验指导书，并在实验中注意安全和准确测量。

十、挑菌步骤及原理？

一、微生物的筛选方法

 1、单菌落挑取法:利用平板划线法或稀释涂布平板法接种在固体培养基表面，根据目的微生物特定的菌落特征，利用单菌落挑取的方法挑选目的微生物。

 2、选择培养法:利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接筛选目的微生物。

 3、鉴定培养法:利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。

 4、根据功能可分为选择培养基和鉴别培养基。

选择培养基

培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌

培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌

以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌

不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物

石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的

培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物

鉴别培养基

伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈深紫色并带金属光泽)

 二、微生物的鉴别方法

 1、菌落特征鉴别法:根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。

 2、指示剂鉴别法:如在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，若培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。

 3、染色鉴别法:如在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，培养某种微生物，若培养基中出现以菌落为中心的透明圈，说明该微生物能分解纤维素。

三、走出微生物培养的4个误区

 (1)不是所有微生物培养基中均需加入特殊营养物质。碳源、氮源、水分、无机盐是微生物生长必需的四大营养。　　　

    成分，有些微生物可自行合成特殊营养物质，而对那些合成能力有限或不能合成特殊营养物质的微生物(如乳酸菌)，则需在培养基中添加诸如维生素等物质。

 (2)稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。而显微计数法由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能比实际值“偏高”。

 (3)平板划线法只适用于微生物的提纯，不适用于微生物的计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。

 (4)倒平板的温度一般在50 ℃左右适宜，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。平板冷却凝固后需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。