ni柱纯化蛋白的原理，镍柱纯化总有一条杂蛋白怎么办？

一、ni柱纯化蛋白的原理，镍柱纯化总有一条杂蛋白怎么办？

his标签与镍金属离子的结合作用是ni柱纯化蛋白的原理。总有一条杂蛋白，有可能是非特异性结合。你可以尝试优化蛋白洗脱方法，将你的目的蛋白与杂蛋白进行分离。

二、蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什？

Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪唑结合。

步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。

挂完之后，按理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要梯度洗脱，拿咪唑和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。

100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度。

咪唑加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用200mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡几次，是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。这是我的经验，楼主可以多方面参考下别人的。喜欢推荐我的答案哦，~\(≧▽≦)/~

三、使用镍柱纯化绿色荧光蛋白的原理是什么？

原理

过渡金属通过与电子供体配基上，能与金属离子相互作用的羧基或氨基的电负性元素（O，N），形成较稳定的金属螯合物。在 IMAC 中，一个 Ni2+ 有六个配位位点，被含有 3、4 或 5 个电子供体基团（配位位点）的螯合物固定在吸附剂上，而剩下未被占据的位点暴露于溶液中，能与组氨酸，半胱氨酸，和色氨酸的侧链或组氨酸标签的蛋白特异性结合。

IMAC 的螯合配基，常见有 IDA（亚氨基二乙酸），NTA（次氮基三乙酸），TED（羧甲基乙，二胺等，分别拥有 3、4、5 个配位位点与 Ni2+ 结合，而空余的能与组氨酸标签结合的位点还剩 3、2、1 个。所以 IDA 与 His 标签蛋白结合力相对最强，特异性较弱，而 TED 则相反。我们在实际应用中通常选择载量与特异性适中的 NTA 类型。

四、镍柱纯化的步骤？

步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化镍，一个柱长体积就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长，然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是一定不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去。

五、镍柱纯化蛋白不挂住怎么办？

有his标签么？

要不就是beads的事？是你自己装的柱么？多长时间了？

还有可能是你的蛋白构象变了，可能把his部分裹在里边了，找找别的条件，或者换NC端。

六、纯化柱原理？

原理

     纯化柱可以用于各种材料的DNAI\RNA的提取以及精制。内装阴阳离子交换树脂，在离子交换反应中，水中的阳离子(如Na+) 被转移到树脂上去了,而离子交换树脂.上的一个可交换的H+转入水中。Na+从水中转移到树脂.上的过程是离子的置换过程。而树脂上的H+交换到水中的过程称游离过程。

       因此，由于置换和游离过程的结果，使得Na+与H+互换位置，这一变化，就称为离子交换。同理，阴树脂置换出0H-，从而生产H20。树脂交换具有交换容量高、水流阻力小、机械强度高、化学稳定性好，同时又具有可逆性的交换反应，便于再生，对各种不同离子吸附的选择来达到除盐、提纯的目的。

       纯水设备的纯化柱是经过离子交流交流原理，便是水中的正离子与离子交流树脂中的H离子交流，水中的负离子与离子交流树脂，上的0H-离子交流，然后到达纯化水的意图。经过离子交流去除离子，理论上简直能除掉-切的离子物质，在25°C时， 出水电阻率可到达18.25MQ。cm。经纯化柱的出水水质的凹凸首要取决于里边装填的离子交流树脂的质量。

七、蛋白纯化过镍柱以后为什么会沉淀？

蛋白浓度过高的时候，会发生聚集而沉淀。有些不易溶蛋白随着镍柱的富集作用就会沉淀。由于不知道你实验目的，简单认为你要纯化表达的蛋白，解决方法：

1. 换更强亲水肽段载体pet50（从酶切链接开始做），但是这样会在表达出来蛋白中增加非目的蛋白成分2. 不要用最佳浓度咪唑洗脱，用稍差一些的，这样洗脱出来蛋白速度慢，浓度低，但是看你是否对浓度要求了。

3. 重新设计引物把输水片段删掉，这样增加可溶性再表达纯化4. 考虑在沉淀里加入稀盐，促溶。但不知对你实验是否有影响

八、histag纯化镍柱优缺点？

His-tag 作为蛋白纯化时的首选标签，其优势在于：

（1） N-端的 His-Tag 与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；

（2）采用 IMAC（固定化金属离子亲合层析）纯化 His-Tag 融合蛋白操作更加简便；

（3）His-Tag 对目的蛋白本身特性几乎没有影响，不会改变目的蛋白本身的可溶性和生物学功能；

（4）His-Tag非常小，一般不影响蛋白质的功能，且在融合蛋白结晶后对蛋白的结构没有影响；

（5）His-Tag 的免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射入动物体内进行免疫并制备抗体；

（6）与其它亲和标签构建成双亲和标签，并可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；His-Tag 融合蛋白的适用范围也较广，既可以在非离子型表面活性剂存在的条件下纯化，也可以在变性条件下进行纯化。前者通常用来纯化疏水性强的目的蛋白，而后者则通常纯化包涵体蛋白。

九、ngc蛋白纯化仪原理？

NGC蛋白纯化系统是一种用于生物学、水产学领域的科学仪器，于2016年10月10日启用。

兼容中高压层析柱/色谱柱的开放平台，配备可扩展系统泵，0.001-10 ml/min 或 0.01-100 ml/min 的系统泵；简单从分析性升级到中试制备级仪器，满足各种通量的要求。

十、his标签蛋白纯化原理？

His标签蛋白纯化原理：组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子能够用鳌合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上，而其他的杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。

结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到较高纯度的 His 标签蛋白。